Extracción fenólica de proteínas

Descripción

La extracción de proteínas con fenol es un método alternativo a la extracción clásica de TCA-acetona. Permite la recuperación eficiente de proteínas y elimina los componentes no proteicos, polisacáridos, lípidos y compuestos fenólicos. Después de la extracción con fenol, las proteínas se precipitan con acetato de amonio en metanol. Esta extracción ha sido probado para electroforesis de una y dos dimensiones (1-DE y 2-DE) con mucha eficiencia.

Material

• Material biologico
• Mortero de cerámica o vidrio
• Guantes de nitrilo o latex
• Micropipetas
• Puntas para micropipetas
• Tubos de 1.5 mL
• Centrífuga
• Sonicador
• Recipiente de plástico para hielo

Reactivos

• Nitrógeno líquido
• Inhibidores de proteasas y fosfatasas
• Acetona
• Sacarosa
• Tris-Base
• KCl
• HCl
• EDTA
• 2-Mercaptoetanol
• PVPP
• Urea
• Tiourea
• CHAPS
• TBP
• Anfolitos
• DTT
• Acetato de amonio
• Metanol

Procedimiento

NOTA: este procedimiento se ha realizado en tejidos de mamífero y plantas, células en cultivo (mamífero, hongos y bacterias).

1. Cuando se utiliza tejido es necesario congelarlo (-80 °C) y después macerarlo en nitrógeno líquido sobre un mortero de cerámica o vidrio.  En caso de usar células en cultivo pasar al paso 3.
2. Se macera el tejido en un mortero evitando que se descongele y se vea pastoso el tejido. Se presiona la muestra con el pistilo hasta que se observe un polvo muy fino (ir al paso 4).
3. Retirar el medio por centrifugación a 2,000 x g durante 4 minutos para células de mamíferos y 5,000 x g para bacterias y hongos. Una vez obtenido el botón celular o el polvo de tejido macerado se transfiera a un tubo 1.5 mL con 1 mL de una disolución acuosa con inhibidores de proteasas y fosfatasas.
4. Se coloca la muestra en un sonicador y se dan 3 pulsos de 1-5 segundos dejando reposar la muestra en intervalos de 10 segundos sobre hielo.
5. Después, se agregan 5 volúmenes de acetona al 99.99% y se deja 1-2 horas a menos 20 grados Celsius (-20°C).
6. Posteriormente se centrifuga a 5,000 x g durante 10 min y se retira el sobrenadante, dejando evaporar la acetona del botón.
7. Se agrega 500 µL de buffer de extracción (ver tabla 1) y 600 µL de fenol sobre el botón, se le da vortex durante 10 min.
8. Se centrifuga a 4,000 x g por 10 min y se recupera la parte acuosa (superior).
9. Se agregan 3 volúmenes de acetato de amonio 0.1 M diluido en metanol y se deja precipitando ≥1 h a menos 70 grados Celsius (-70°C).
10. Se centrifuga a 4,000 x g por 20 min y se lava 3 veces con acetato de amonio-metanol. El último lavado se realiza con acetona al 99.9%
11. Se evapora la acetona en una centrífuga de vacío (speed vac) o se deja evaporar boca abajo. NOTA: no lleve a sequedad total.
12. Se solubiliza el botón con el buffer de solubilización (ver tabla 2) con 50-500 µL dependiendo del tamaño de la muestra. Este buffer de solubilización es compatible para geles 2D-PAGE (para más detalles consultar el método de Geles de 2D-PAGE)
13. Centrifugar a 13,000 x g por 20 min para retirar el material insoluble, deposite el sobrenadante en un tubo nuevo y cuantifique la muestra (ver método de cuantificación Bradford).

Tabla 1. Buffer de extracción

Tabla 2. Buffer de solubilización de proteínas

*NOTA: el rango de pH de las anfolitos se usarán dependiendo de las necesidades del experimento.